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產品規(guī)格

產品簡介

Firefly&Renilla Luciferase Reporter Gene Assay Kit首先以D-熒光素鉀鹽為底物來檢測螢火蟲螢光素酶報告基因的活性，之后在淬滅該螢光反應的同時，以腔腸素-h 為底物檢測海腎螢光素酶報告基因的活性。該試劑盒具有靈敏度高的特點，可在單個樣品中同時檢測螢火蟲和海腎熒光素酶的活性，適用于雙報告基因檢測。

產品組分

保存條件

-20℃保存，12 個月有效；海腎熒光素酶底物（100×）建議分裝 -80℃保存。

使用說明

1.裂解細胞：將細胞裂解液充分混勻后，按如下方式加入報告基因細胞裂解液，充分裂解細胞。
a.對于貼壁細胞：吸盡細胞培養(yǎng)液后，參考下表加入適量的報告基因細胞裂解液；對于懸浮細胞：離心去上清后，參考下表加入適量報告基因細胞裂解液。

冰上孵育5-10 min ，充分裂解細胞。

注：如果螢光素酶的表達水平比較低，可以嘗試使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以最小為100微升。
b.充分裂解后，10,000-15,000×g 離心3-5分鐘，取上清用于測定。（選做）
注：細胞裂解后可以立即測定螢光素酶，也可以先凍存，待以后再測定。凍存樣品需融解，并達到室溫后再進行測定。裂解產物可在4℃保存12 h，-20℃/-80℃可長期存放。（裂解產物反復凍融5次無影響）。
2.融解螢火蟲螢光素酶檢測試劑和海腎螢光素酶檢測緩沖液，并達到室溫。海腎螢光素酶檢測底物(100×)置于冰浴或冰盒上備用。
3.按照每個樣品需100微升檢測液的量，取適量海腎螢光素酶檢測緩沖液，按照1:100加入海腎螢光素酶檢測底物(100×)配制成海腎螢光素酶檢測工作液。例如，1毫升海腎螢光素酶檢測緩沖液中加入10微升海腎螢光素酶檢測底物(100×)充分混勻后即可配制成約1毫升海腎螢光素酶檢測試劑。

4.取20 μL裂解液加至待檢測的96孔板中，按照實驗需求，可設置3-5個重復孔。

5.加入100 μL螢火蟲螢光素酶檢測試劑，震板混勻，檢測螢火蟲熒光素酶的活力，檢測盡量在30 min內完成。

6.加入100 μL海腎熒光素酶檢測試劑，震板混勻，檢測海腎熒光素酶的活力，檢測盡量在30 min內完成。
7.分析數據：

①實驗設計：根據不同實驗目的，在每個培養(yǎng)板中都應設置對照組、實驗組和空白對照組。為了保證實驗準確性，理論上每個實驗組（包括對照組）都應當減去空白對照組的螢火蟲和海腎螢光素酶的發(fā)光測量值。

a.空白對照組：

背景F：未轉染細胞+螢火蟲螢光素酶檢測試劑。

背景R：未轉染細胞+螢火蟲螢光素酶檢測試劑+海腎螢光素酶檢測試劑。

注：空白對照組的樣品量必須與實驗樣品量相同，包含與實驗樣品相同的培養(yǎng)基/血清組合，并加上完全相同的檢測試劑。
b.實驗組：轉染細胞經實驗化合物處理(即實驗組F和實驗組R)。
c.對照組：轉染細胞不經處理，用以標準化結果(即對照組F和對照組R)。

②計算結果：

實驗組比值=(實驗組F-背景F）/(實驗組R-背景R)。

對照組比值=(對照組F-背景F）/(對照組R-背景R)。

表達倍數=實驗組比值/對照組比值。

注意事項

1.反應溫度：酶促反應對溫度較為敏感，加樣檢測前務必將所有試劑平衡至室溫（20-25℃）再使用；

2.檢測儀器：能檢測化學發(fā)光的儀器都適用，但由于不同儀器的設置和靈敏度不同，測得的光信號值也會不同；

3.檢測板：為防止孔間干擾，推薦使用不透光白色酶標板。黑色酶標板也可用，但因黑色會吸收光信號，可能會降低信號；

4.D組分海腎螢光素酶底物易揮發(fā)，注意密封保存；

5.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套。

6.本產品僅供科研使用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

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